Ацион

Блокирование теломеразы в раковых клетках, а также блокирование альтернативного удлинения теломер в этих клетках (Alternative Lengthening of Telomeres – АLT), что приводит к апоптозу (гибели) раковых клеток.

Способствует регуляции субтеломерной ДНК в раковых клетках, кодирующей апоптотические и антиапоптотические белки (белки смерти и «бессмертия» раковых клеток).

Состав: экстракт брокколи (стандартизованный по ASF-1, RPA, блокирование альтернативного удлинения теломер (ALT), экстракт зелёного чая (ингибиторы теломеразной обратной транскриптазы (TERT), теломеразной РНК, Sp1, ETS) , кверцетин (регуляция Bcl-2, p53, p73, p21, p16), ресвератрол (регуляция PRB, E2F, USF-1, USF-2, Mdm2, WT-1, MZF-2), экстракт куркумы (регуляция TGF-β1, SP600125, ингибирование JNK / MAPK, ETS, антрагликозиды), индол-3-карбинол (регуляция антиэстрогенов, активация рецептора Ck), дииндолилметан (регуляция антиандрогенов), полифенольный комплекс крестоцветных (антисмысловые олигонуклеотиды, 2-O-метил-РНК-фосфотионат-олигонуклеотиды (ингибитор ETS), гемагглютиновый эпитоп, индолы против онкогенных вирусов), крахмал.

Компоненты формулы Ацион блокируют альтернативное удлинение теломер в раковых клетках, что приводит к их гибели.

Рак и альтернативное удлинение теломер. При всем типовом разнообразии раковые опухоли имеют общую черту – беспредельное деление клеток. В значительной степени этот нерегулируемый рост обусловлен тем, что опухолевые клетки могут восстанавливать защитные концы своих хромосом, состоящие из повторяющихся последовательностей ДНК и белков. Как правило, деление клеток останавливается, как только эти структуры, называемые теломерами, «изнашиваются» и становятся слишком короткими. Но раковые клетки продолжают делиться, используя одну из двух стратегий их восстановления.

Одна из стратегий, реализуемая в 90% видов рака, основана на усилении синтеза фермента теломеразы, удлиняющего теломеры. Против этого в состав Ациона входят антраценовые производные, которые успешно блокируют теломеразу в раковых клетках. Однако мы начнем с альтернативного удлинения теломер. Итак, изучена стратегия, используемая оставшимися 10-15% видов рака, называемая альтернативным удлинением теломер (ALT). До сих пор объяснение биологами феномена альтернативного удлинения теломер, по существу сводилось к тезису: раковые клетки могут восстанавливать длинные, хотя и «неряшливого» вида, теломеры без теломеразы. Однако, как именно это делается, оставалось неясным.

Профессор молекулярной и клеточной биологии Института биологических исследований Солка Ян Карлзейдер и сотрудники его лаборатории сообщают о первой индукции ALT-программы восстановления теломер в клетках человека. Это открытие представляет факторы, являющиеся драйверами ALT-зависимого роста раковых клеток, как фармакологические мишени.

Профессор Карлзейдер занимается изучением того, как биохимия теломер влияет на развитие рака и процесс старения.

«Таргетинг теломеразы давно считается методом лечения рака» – поясняет ученый, отмечая, что антителомеразные препараты уже доказали свою эффективность. «Но исследования на мышах показывают, что при подавлении теломеразы клетки могут активировать программу альтернативного удлинения теломер. Это делает необходимой разработку способов блокирования удлинения теломер – ALT».

Чтобы узнать, как именно клетка включает программу альтернативного удлинения теломер, исследователи экспериментально удалили два белка, ASF1a и ASF1b в нормальных клетках легких и в клетках раковой линии, бессмертие которых обусловлено теломеразой. Шапероны ASF1 – молекулярные сопровождающие гистоновых белков, комплекс которых с ДНК является структурным блоком хромосомы-нуклеосомы.

В ASF1-дефицитных клетках, учитывая потерю гистонового шаперона, ученые наблюдали относительный дефицит нуклеосом в области теломер. При этом лишенные ASF1 раковые клетки продолжали делиться, хотя синтез теломеразы в них выключается, что могло означать только одно: опухолевые клетки умеют использовать вторую стратегию удлинения теломер.

Но самое интересное показала микроскопия: ядра лишенных ASF1 клеток содержали агрегаты теломерной ДНК, известные как PML-тельца, названные так потому, что впервые белки обнаружены в опухолевых клетках при промиелоцитной лейкемии (promyelocytic leukemia), являются характерным признаком ALT-зависимых типов рака.

«Масштабное образование PML-телец в нормальных клетках было неожиданностью», — комментирует первый автор статьи Родди О. Саливан, постдокторант лаборатории профессора Карлзейдера. «Это было первой подсказкой о том, что программа альтернативного удлинения теломер индуцируется потерей белков ASF1».

Чтобы подтвердить, что клетки включают ALT, ученые использовали все возможные средства. В качестве решающего аргумента постдокторант лаборатории Карлзейдера, соавтор исследования, Носика Арну прибегла к флуоресцентной микроскопии. В теломерный участок одной из хромосом ее коллеги встроили флюоресцентную метку, а она отследила, где эта метка оказалась с течением времени, применив метод FISH, позволяющий визуализировать целую хромосому. Она установила, что потеря ASF1 инициировала своего рода внутренний «пинг-понг»: клетки размножили метку и перебрасывали ее из хромосомы в хромосому, выстраивая дезорганизованные, но «пригодные к эксплуатации» теломеры.

Обмен теломерной ДНК между хромосомами – золотой стандарт обнаружения альтернативного удлинения теломер. Потеря ASF1 является индуктором ALT.

До сих пор ученые, занимающиеся изучением рака, придерживались мнения, что обмен теломерной ДНК при альтернативном удлинении теломер может объясняться мутациями в генах, ограничивающих процесс рекомбинации. Возвращаясь к метафоре с пинг-понгом, эти мутации заставляли бы клетки потерять контроль над ракеткой. Но профессор Карлзейдер уверен, что результаты их исследования просто не оставляют места для дискуссий – молекулярный исходный пункт альтернативного удлинения теломер больше не является предметом споров.

«Наша работа показывает, что подавление ASF1 вызывает альтернативное удлинение теломер за счет нарушения сборки нуклеосом», — «таким образом, наблюдаемая нами рекомбинация в ALT-зависимых клетках является следствием, а не причиной».

Ацион является в том числе ингибитором ALT.

Но основное действие Ациона при онкозаболеваниях – это регуляция теломеразы в онкогенезе, приводящая к апоптозу (гибели) раковых клеток.

Теломераза – сложный рибонуклеопротеид, достраивающий в клетках теломерные концы хромосом, укорачивающиеся из-за недорепликации ДНК. Кодовый фрагмент состоит из белковой каталитической субъединицы (теломеразная обратная транскриптаза, TERT – Telomerase Reverse Transcriptase) и теломеразной РНК (TR – Telomerase RNA), небольшой определенный участок которой служит матрицей для синтеза теломерных повторов. Активность теломеразы не проявляется в соматических клетках и тканях человека за редким исключением. Активация теломеразы в раковых клетках достоверно показана в 90% случаев.

Понимание того, как работает теломераза, и регулирующих ее работу механизмов было использовано при создании формулы средства Ацион, в котором сама теломераза и ее регуляторы являются важными мишенями антиракового подхода.

В 1961 году Хейфлик и Мурхад показали, что культуры соматических клеток имеет ограниченный период жизни. В 1973 году Оловников предположил, что укорочение концов хромосом (теломер) определяет возможное число делений клетки. Теломеры защищают геном клетки от деградации, участвуют в мейотическом спаривании хромосом и в регуляции транскрипции генов прителомерной области. В клетках, способных размножаться бесконечно (бессмертных), должен существовать механизм, компенсирующий укорочение теломер. В 1985 году Блекберн и Грейберг открыли фермент, удлиняющий теломеру – теломеразу.

Теломераза – рибонуклеопротеиновый комплекс, состоящий из абсолютно необходимых для активности компонентов: молекулы РНК – TR и теломеразной обратной транскриптазы – TERT; также в состав теломеразы может входить ряд ассоциированных с ним белков. TR является матрицей для TERT при удлинении теломер с помощью теломеразы. Теломераза в клетках человека существует в виде димера и содержит две субъединицы обратной транскриптазы и две молекулы РНК. В теломеразе человека с hTERT связывается: р23/р90-шаперон, отвечающий за сборку/конформацию комплекса; 14-3-3, обеспечивающий ядерную локализацию; TP1 с неизвестной функцией. С hTR связываются белки hGAR1, Dyskerin/NAP57, hNHP2, C1/C2, отвечающие за стабильность, созревание и локализацию РНК; La, hStan, вероятно, отвечающие за присоединение к теломерам; L22, участвующий в процессинге ядерной локализации; hNOP10, A1/UP1, TP1 c неизвестными функциями, TCAB1, отвечающий за локализацию hTR в тельцах Кахаля и связывание с теломерами. Ферментативная активность теломеразы человека в лизате ретикулоцитов детектируется при добавлении hTR и hTERT. Заметим, что выполнение теломеразой своих фунцкий in vivo не всегда совпадает с наличием теломеразной активности, измеренной in vitro. Например, добавление гемагглютинового эпитопа на С-конец hTERT при сохранении теломеразной активности удлинения теломер.

Детектируемая in vitro теломеразная активность появляется в лейкоцитах в G1-фазе. С другой стороны, in vivo теломеры реплицируются во время S-фазы. В течение большей части клеточного цикла hTR накапливается в тельцах Кахаля при помощи TCAB1, в S-фазе совмещаясь с теломерами в клетках. hTERT также в S-фазе клеточного цикла перемещается на теломеры. Это свидетельствует о существовании регуляции на уровне пространственной локализации активной теломеразы (фермента) и теломеры (субстрата). Не всегда наблюдается корреляция активности теломеразы и длины теломер. Например, при лейкемии зависимость между длиной теломер и активностью теломеразы отсутствует.

Активность теломеразы в зависимости от числа делений хорошо описывается двухшаговой гипотезой клеточного старения и обретения бессмертия (иммортализации) – теорией М1/М2. В эмбриональных клеточных линиях теломераза активна, и длина теломер поддерживается на постоянном уровне. В стволовых клетках активность теломеразы ниже и позволяет лишь частично компенсировать укорочение теломер. В соматических клетках активность теломеразы отсутствует. Укорочение теломер приводит в момент М1-достижение предела Хейфлика – к переходу клеток в состояние сенесценции (старения), которое может быть преодолено активацией (удалением) рRB/p16 или р53. Клетки, преодолевшие М1, продолжают делиться и входят в состояние кризиса М2, сопровождающееся массовой клеточной смертью. Уцелевшие клетки перерождаются в раковые. Раковые клетки способны к неограниченному делению и поддержанию длины теломер (как правило, с помощью теломеразы). Если экспрессирующие hTR соматические клетки трансфицировать геном hTERT момента M2, в них, как и в раковых, происходит удлинение и стабилизация теломер.

Активность теломеразы не проявляется в соматических клетках и тканях человека за редким исключением. Показано ее наличие в репродуктивных тканях, а также в быстро обновляющихся тканях, например, в некоторых клетках крови, кишечным эпителии и базальном слое клеток кожи, при этом в соматических клетках с активной теломеразой уровень ее активности ниже, чем в раковых.

Частота детекции теломеразной активности в различных опухолях. В большинстве опухолевых клеток (80-90%) теломераза активна и является основным инструментом поддержания длины теломер. Доброкачественные опухоли и другие предраковые поражения представлены как опухолями, в которых теломеразная активность проявляется почти в 100% случаев, так и опухолями, в которых активность теломеразы не определяется. Опухолевые клетки некоторых типов, как было сказано ранее, могут использовать альтернативный механизм поддержания длины теломер, основанный на рекомбинации.

Хотя при трансфекции геном hTERT клеток с альтернативным механизмом поддержания теломер работают оба механизма, при объединении клеточных линий с разными механизмами в гибридах присутствует теломераза, а признаки альтернативного механизма удлинения теломер пропадают. Следует отметить, что сама по себе теломераза не является онкогеном (!). Клеточные линии, трансформированные геном hTERT, долгое время не показывают признаков злокачественной трансформации.

Активность теломеразы может появляться вследствие отбора клонов при критическом укорочении теломер. Сначала клетки начинают усиленно делиться, при этом у них укорачиваются теломеры, затем выживают те из них, у которых активизируется теломераза. В этом случае теломеразная активность может быть маркером опухолевой прогрессии и отрицательного прогноза. Так, при лимфогранулематозе основное увеличение активности теломеразы происходит при переходе от первой ко второй стадии. При другом варианте развития событий теломеразная активность появляется одновременно с другими ведущими к раку нарушениями метаболизма вследствие исходного клеточного поражения. В этом случае активность теломеразы появляется в самом начале заболевания и служит маркером начала онкологических процессов. Например, при раке шейки матки нет зависимости активности теломеразы от стадии рака – теломераза активна уже на первой стадии, а ее активация происходит во время предопухолевых заболеваний. Теломераза может быть исходно активна в исследуемом типе клеток, и эта активность лишь усиливается при переходе к раку, например, при гемобластозе. Также теломераза может быть исходно активна в случае перерождения стволовой клетки. В этом случае теломеразная активность будет обнаруживаться при начале роста опухоли, поскольку метод ее детекции не позволяет увидеть активность из одной клетки на фоне окружающей ткани, но уже небольшой пул теломераза-положительных клеток будет заметен.

Амплификация генов hTR и hTERT. Ген, кодирующий hTR, представлен одной копией, находящейся на хромосоме 3 в положении 3q26.3. Этот участок хромосомы 3 часто амплифицируется, например, в раках шейки матки, легкого и плоскоклеточной карциноме головы и шеи. Число копий гена hTR возрастает в опухолевых клетках по сравнению с нормальными, и, в соответствии с этим усиливается и экспрессия hTR в раках шейки матки и плоскоклеточной карциноме головы и шеи.

Ген hTERT расположен на хромосоме 5 в положении 5q15.33, в регионе, который тоже часто амплифицируется в ряде раков. Поскольку амплификация теломеразных генов происходит в процессе амплификации хромосом, содержащих эти гены, а не во время специфической амплификации локусов, можно сделать вывод о неспецифичности этого процесса. В случае плоскоклеточных карцином шейки матки активация экспрессии hTERT не связана с амплификацией гена hTERT. С другой стороны, эта амплификация может происходить в результате хромосомной нестабильности и анеуплодии, возникающих при критическом укорочении теломер.

Транскриптов hTERT мало или они вовсе не детектируются в большинстве тканей человека, но часто наблюдаются в этих же тканях после неопластической трансформации.

Структура промотора обратной транскриптазы теломеразы (hTERT). Промотор hTERT не содержит блоков ТАТА и СААТ, характерных для посадки РНК-полимеразы II, и является GC-богатым.

Существуют разные данные о местоположении участка инициации транскрипции. Здесь и далее нумерация нуклеотидов в промоторе будет от А (точка +1 нп (нуклеотидная пара)) в триплете ATG, с которого начинается трансляция. С помощью метода защиты от РНКазы обнаружено несколько защищаемых участков в разных hTERT положительных клеточных линиях, что говорит о возможности наличия нескольких сайтов инициации транскрипции (в области – 40-100 нп). Наиболее общим является защищенный участок, которому соответствует положение участка инициации транскрипции в положении – 55 нп от начала трансляции. В работе, анализируя кэпированную мРНК клеточной линии HeLa, обнаружили сайт старта транскрипции в положении – 77 нп. В настоящее время в большинстве работ именно это положение принимается за основное.

Сайты, отвечающие за регуляцию транскрипции hTERT, сосредоточены на участке в 2000 нуклеотидных пар до сайтов инициации трансляции и транскрипции. Наиболее важным для активации является участок от 250-300 нп перед ATG до нескольких десятков нп после. Кроме того, GC-богатый участок промотора формирует CpG-островки рядом с ATG, указывая на возможность участия метилирования в регуляции экспрессии hTERT.

Активность промоторов связана с расположением на нем различных участков связывания регуляторных белков, которые не только взаимодействуют с промотором, но и являются посредниками действия других регуляторов.

Метилирование промотора hTERT. В опухолевых клетках профиль метилирования отличается от профиля нормальных клеток. Анализ промотора теломеразы выявил два CpG-островка, один из которых находится в положении – 900 нп от стартового кодона ATG.

В случае раковых клеточных линий и тканей рака кишечника оказалось, что в них экспрессируется hTERT и CpG-островки промотора hTERT полностью или частично метилированы. При длительной обработке деметилирующим агентом 5-аза-2-дезоксицитидином (5azadC) клеточных линий Lan-1, Hela, Co115, в которых теломераза активна, а промотор hTERT гиперметилирован, показано снижение уровня метилирования промотора hTERT на 95% и уменьшение уровня экспрессии мРНК hTERT. Активность теломеразы сильно падает после 2-4 пересевов клеток в присутствии 5azadC.

Маркеры активного хроматина и экспрессия теломеразы детектируются, когда участок промотора hTERT – 73+227 нп вокруг сайта транскрипции не метилирован. В нормальных клетках гиперметилирование промотора hTERT угнетает активность теломеразы и экспрессию мРНК hTERT, и при их обработке 5azadC теломераза активируется. Анализ метилирования промотора hTERT у пациентов с хроническими В-клеточными лимфоидными лейкозами показал, что при высокой теломеразной активности заметно снижен уровень метилирования. Нет зависимости активности теломеразы от статуса метилирования промотора hTERT для клеточных линий остеосаркомы, образцов тканей раков яичника, шейки матки и нормальных тканей.

Такой разброс данных говорит о том, что метилирование ДНК не является критическим фактором регулирования экспрессии теломеразы при раке. Оно происходит одновременно с другими нарушениями системы регуляции промотора hTERT. Кроме того, как метилирование, так и деметилирование могут влиять на трансрегуляторы теломеразы, а не на сам промотор.

Метилирование гистонов промотора hTERT. Метилирование гистонов, проводимое метилтрансферазами и деметилазами гистонов, играет важную роль в регуляции структуры хроматина и транскрипции. Метилтрансфераза SMYD3, участвующая в онкогенезе, специфично активирует ген теломеразной обратной транскриптазы. Эта метилтрансфераза занимает свой участок связывания на промоторе hTERT и триметилирует гистон Н3-К4. Подавление SMYD3 в раковых клетках упраздняет триметилирование Н3-К4, ослабляет связывание с промотором транс-активаторов Sp1 и c-Myc и приводит к пониженному ацетилированию гистона Н3 в промоторе hTERT, что приводит к сокращению количества мРНК hTERT и снижению теломеразной активности.

Ацетилирование и деацетилирование гистонов промотора hTERT. Ацетилтрансферазы GCN5 и Tip60 ацетилируют гистоны Н3 и Н4, что приводит к активации транскрипции hTERT. Эти же ацетилтрансферазы ацетилируют Myc, что приводит к уменьшению его деградации, и другие белки, участвующие в транскрипции генов, что может опосредовано регулировать промотор hTERT. Ацетилтрансфераза р300 и сопутствующий СВЗ-транскрипционные коактиваторы, которые взаимодействуют с большим количеством сиквенс-специфических транскрипционных факторов, в том числе являются коактиваторами онкосупрессора р53. р300 является коактиватором транскрипции hTERT, который приносится на промотор белком с-Myc. Хотя р300 и СВР могут стабилизировать Myc независимо от ацетилирования, проводимое р300 ацетилирование при этом снижает уровень связывания Myc с промотором. Таким образом, р300 может участвовать и в активации, и в ингибировании промотора hTERT. Комплекс Myc/Max по-разному ацетилируется р300 и GCN5 и не ацетилируется Tip60 in vitro, что говорит о различных механизмах действия этих ацетилтрансфераз.

Деацетилирование гистонов приводит к снижению экспрессии hTERT. Суперэкспрессия деацетилаз гистонов (HDAC1) приводит к подавлению активности промотора hTERT. HDAC1 связывается с промотором теломеразы, угнетает теломеразную активность и взаимодействует с Sp1. Деацетилазы гистонов могут взаимодействовать с промотором hTERT с помощью белка Mad1, связывающегося с Е-блоками. Ингибирование деацетилирования гистонов приводит к увеличению экспрессии и активности теломеразы в нормальных, но не в раковых клетках (клеточные линии рака легкого) с уже активной теломеразой. Можно предположить, что в случае рака деацетилирование гистонов уже выключено.

Каскад МАРК. Сигнальный каскад митоген-активируемой протеинкиназы МАРК, эффектора внеклеточныых сигналов роста и сигналов стресса, может регулировать транскрипционную активность многих промоторов за счет прямого фосфорилирования Sp1 или по иным механизмам. Сигнальный путь МАРК важен для регуляции транскрипции hTERT через ряд эффекторов, связывающихся с участками в его основном промоторе, включая транскрипционные факторы с-Myc, AP-1 и Ets. Подавление каскада МАРК приводит к ослаблению фосфорилирования рецептора эстрогена бета (ERβ) и уменьшению связывания ERβ с промотором hTERT с соответствующим снижением уровня экспрессии hTERT.

Онкоген MYC и его антипод MAD. В положениях 242 и 34 гена hTERT находятся Е-блоки, с которыми взаимодействует онкопротеин с-Myc, являющийся одним из основных активаторов транскрипции hTERT. Этот белок является также транскрипционным активатором целого ряда промотором других генов и ингибитором транскрипции генов, участвующих в остановке роста клеток.

Наблюдение воздействия антисенсолигонуклеотидов с-Myc, подавляющих его экспрессию, на 3 клеточные линии лейкемии выявило падение в этом случае и теломеразной активности. с-Myc индуцирует транскрипцию hTERT и теломеразную ативность в нормальных клетках эпителия молочных желез и первичных фибробластах человека. Высокий уровень с-Myc приводит к активации промотора hTERT, а при удалении Е-блоков этот эффект теряется. Нарушение связывания с-Myc имеет разный эффект в различных клеточных линиях. Так, введение мутаций в Е-блок, находящийся в положении 242 нп, в клетках линий С33А и МЕ180 приводит к падению активности промотора hTERT на 70%, а в клетках линии SiHa такие мутации имеют незначительный эффект. При введении мутаций в Е-блок, находящийся в положении 34 нп, происходит снижение активности промотора hTERT на 60% в клетках МЕ180, тогда как в клетках С33А и SiHa активность промотора hTERT происходит быстро и независимо от клеточной пролиферации и белкового синтеза. Гетеродимеры и с-Myc/Max взаимодействуют непосредственно с промотором hTERT.

Другим активатором теломеразы является белок N-Myc. Амплификация этого гена в нейробластоме наблюдается одновременно с активацией промотора hTERT. Показано связывание N-Myc с промотором hTERT.

Белок Mad является антиподом с-Myc и ослабляет активность промотора hTERT, связываясь с Е-блоками в виде гетеродимера Mad/Max. Угнетение промотора hTERT белком Mad требует наличия активных деацетилаз гистонов. При этом ингибирование деацетилаз гистонов с помощью TSA не зависит от наличия Е-блоков в промоторе hTERT.

Транскрипционные факторы SP1 и SP3. Белок Sp1 регулирует ряд специфических промоторов, инициирующих транскрипцию у организма РНК-полимеразой II. Sp1 связывается с последовательностью GGGGCGGGGC и сходными с ней последовательностями, называемыми – GC-блоками. Он регулирует промоторы как hTERT, так и hTR.

В промоторе hTERT находится серия участков связывания Sp1, необходимых для активности промотора. Подобные кластеры часто встречаются и в других, не содержащих TATA-бокса промоторах и необходимы для их полной активации. Известно 5 участков связывания Sp1 в основном промоторе между Е-блоками. 2 участка связывания Sp1 совпадают у человека и мыши. В регуляции, судя по активным участкам промотора, принимают участие сайты Sp1, находящиеся между Е-блоками, внесение мутаций в которые приводит к падению активности промотора в В случае выключения всех 5 участков связывания происходит снижение активности промотора hTERT на 90%, то есть Sp1 абсолютно необходим для его активности. Интересно, что если при наличии участков связывания Sp1 введение c-Myc активирует промотор hTERT, то, когда их нет, активация промотора hTERT белком c-Myc незначительна. Вероятно, в регуляции участвуют два мало исследованных участка связывания Sp1, находящихся в районе 320-350 нп от сайта трансляции и, возможно, два предполагаемых участка в районе 800-1000 нп. Расположенные далее от сайта начала транскрипции участки связывания не принимают участие в регуляции транскрипции hTERT.

Другим повсеместно экспрессируемым белком семейства Sp является белок Sp3, который часто выступает конкурентным ингибитором Sp1. Изменение соотношения этих двух белков в пользу Sp3 приводит к ингибированию транскрипции hTERT.

И Sp1 и Sp3 также требуются для депрессии промотора hTERT деацетилазами гистонов, связывая их с промотором hTERT. Кроме вышеизложенного, Sp1 является посредником целого ряда как активаторов, так и ингибиторов транскрипции hTERT.

Ядерный фактор NF-kB. NF-kB контролирует экспрессию и функции ряда генов, участвующих в развитии рака, в том числе c-Myc, являющегося трансактиватором теломеразы. Когда белок Tax человеческого лимфотрофического вируса 1-го типа (HTLV-1) активирует NF-kB, происходит последовательное повышение активности промоторов c-Myc и hTERT. Иммунопреципитация хроматина показала усиление связывания с-Myc и Sp1 c промотором hTERT при его активации NF-kB.

Экспрессия генов NF-kB и hTERT происходит одновременно и увеличивается на ранних стадиях появления рака желудка. Одновременный синтез с hTERT и наличие потенциальных сайтов связывания NF-kB в промоторе hTERT позволяют предположить, что NF-kB участвует в активации теломеразы. Активация промотора hTERT в результате связывания с ним NF-kB доказана.

NF-kB (р65 субъединица) может взаимодействовать с деацетилазами гистонов (HDAC1), за счет этого участвуя в отрицательной регуляции экспрессии генов. Деацетилазы гистонов ингибируют промотор hTERT, связываясь с ним с помощью Sp1. NF-kB в случае его связывания с промотором может использоваться для связывания HDAC1.

Транскрипционные факторы АР1 и АР2. Транскрипционный фактор АР1 (activator protein 1) участвует в процессах клеточной пролиферации, дифференцировки, канцерогенеза и апоптоза и экспрессируется как в раковых, так и в нормальных клетках. Он является гетеродимером Jun (c-Jun, Jun B, Jun D) и Foc (c-Foc, Foc B, Fra-1 или Fra-2).

Суперэкспрессия АР1 приводит к подавлению транскрипции hTERT в клеточной линии HeLa). Комбинация с-Fos и c-Jun или c-Fos и Jun D уменьшает активность промотора hTERT на 80% в опытах с кратковременной экспрессией. Участок промотора hTERT между нуклеотидами 2077 и 455 нп принимает в этом участие. Jun D и c-Jun связываются с обоими предполагаемыми участками связывания Ар1 в положениях 1732 и 795 нп. Внесение мутаций в участки связывания АР1 на промоторе hTERT нивелирует вызываемое АР1 ингибирование. При амелобластоме обнаружена корреляция между экспрессией c-Fos, одной из субъединиц АР1, и экспрессией мРНК hTERT.

Промотор hTERT также содержит потенциальный участок связывания АР2. АР2 связывается с участком 121-129 промотора hTERT. В клетках линии рабдомиосаркомы мутация в участке связывания АР2 приводит к уменьшению активности промотора. При этом суперэкспрессия АР2 не приводит к увеличению активности промотора hTERT.

Онкосупрессоры р53 и р73. Белок р53 регулирует множество генов, участвующих в контроле клеточного цикла и онкогенезе (р21, MDM-2, Bax, c-Fos/Jun, pRB, 14-3-α, Bcl2 и ряд других). р53 противодействует онкогенезу, включая механизмы ареста клеточного цикла и апоптоза в ответ на различные поражения клетки. Этот белок неактивен более, чем в половине типов человеческих опухолей. Восстановление функционального р53 в раке шейки матки, лимфоме, раках молочной и поджелудочной желез приводит к ингибированию теломеразной активности за счет подавления экспрессии hTERT. Этот эффект проявляется в течение нескольких часов после индукции р53, до того, как происходит нарушение клеточного цикла и начинается апоптоз.

Мутации в доменах р53, ответственных за связывание деацетилаз гистонов и корепрессора Sin3A, не влияют на угнетение hTERT, хотя деацетилазы участвуют в ингибировании транскрипции hTERT белком р53. Мутации р53 в домене связывания с ДНК, домене олигомеризации или домене активации транскрипции приводит к реактивации р53 по отношению к теломеразе. При этом р53 не связывается in vivo с промотором hTERT, то есть его действие на промотор непрямое. р53 может использовать в качестве посредников белки р21, Е2F и белки группы pRB.

Для проявления ингибирования р53 необходим Sp1. Мутации в участках связывания Sp1 ликвидируют подавление активности промотора hTERT с помощью р53. Эксперименты в клетках показали, что активация промотора hTERT, зависящая от эктолитической экспрессии Sp1, аннулируется р53 дикого типа. р53 взаимодействует с Sp1 и предотвращает его связывание с промотором hTERT in vitro. р53 использует в качестве посредника белок р21.

Белок р73 проявляет онкосуппрессорные функции, подобно р53. Изучение на вырабатывающих р53 клетках показало, что суперэкспрессия С-концевых изоформ р73 приводит к уменьшению активности промотора hTERT. Угнетение экспрессии hTERT происходит при посредничестве эндогенного р73 после активации E2F1 в клетках. Мутации в участках связывания Sp1 в основной части промотора hTERT нивелируют регрессию промотора hTERT с помощью р73, свидетельствуя об участии Sp1 в этом процессе в качестве посредника. Кроме того, р73 связывается с Sp1, что подтверждает участие Sp1 и р73-зависимом угнетении экспрессии hTERT.

Белки PRB, E2F, p21 и p16. Пониженная экспрессия E2F наблюдается при более агрессивном течении болезни. Также E2F регулируется белком PRB.

Белок E2F связывается с промотором теломеразы в двух специфичных участках (в районах 251 и 175 нп). Кроме того, на участке 67-61 нп присутствует неклассический участок связывания E2F. E2F снижает экспрессию мРНК hTERT и активность теломеразы в клетках линий плоскоклеточной карциномы. Эктопическая экспрессия E2F уменьшает активность промотора теломеразной обратной транскриптазы в клетках линий HeLa, U2OS, 273 при посредничестве Sp1.

Суперэкспрессия PRB тоже снижает активность промотора hTERT и активность теломеразы. При исследовании глиобластомы при более прогнозе обнаружена корреляция в экспрессии E2F и hTERT. Эктопическая экспрессия экзогенного E2F увеличивает активность промотора hTERT в клеточных линиях Saos-2, HeLa и U-251 MG. Критично для ингибирования промотора hTERT белками E2F не только их наличие, но и их посттрансляционные модификации и модификации PRB, участвующие в этом каскаде.

E2F является одним из посредников р53. Мутации неканонического участка связывания E2F и суперэкспрессия мутанта E2F, способного связываться с ДНК, но с отсутствующими доменами трансактивации и связывания PRB, приводят к полному нивелированию влияния р53. Такой же эффект наблюдается при угнетении белка PRB.

Суперэкспрессия р21 и PRB подавляет экспрессию hTERT и останавливает клеточный цикл в раковых клетках, на примере клеток линии Г-251MG. Появление в клетках белка р21, ингибитора циклин-зависимых киназ, приводит к накоплению гиперфосфорилированной активной формы PRB, P130, p107. Эти белки связываются с белками семейства E2F, переводя их из активаторов транскрипции в регрессоры. Восстановление количества PRB в PRB- и p53-негативных раковых клетках приводит к угнетению теломеразной активности и остановке клеточного цикла. Для функционирования PRB как ингибитора промотора hTERT критично фосфорилирование PRB. Ингибирующее действие PRB может объясняться связыванием с промотором hTERT, в том числе с привнесением дополнительных ингибиторов, например, деацетилаз гистонов. Также PRB может нарушать связывание E2F с промотором hTERT. PRB и E2F могут регулировать экспрессию и независимо друг от друга.

Белок-онкосупрессор р16 участвует в регуляции системы PRB/E2F. Его экспрессия заметно снижает уровень теломеразной активности в клеточных линиях опухолей, включая глиому. р16 ингибирует связывание Sp1 с его участками связывания в промоторе.

BcL-2 – один из факторов апоптоза. Суперэкспрессия BcL-2 в человеческих раковых клеточных линиях с низким эндогенным уровнем экспрессии этого белка сопровождается понижением уровня теломеразной активности.

Онкосупрессор WT1. В подавлении теломеразной активности участвует онкосупрессор WТ1. В промоторе hTERT в положении 352 нп находится участок связывания WT1, мутации которого могут увеличивать активность промотора hTERT. Суперэкспрессия WT1 подавляет экспрессию мРНК hTERT и теломеразную активность в клетках опухолей. Поскольку ген WT1 экспрессируется в определенных типах клеток при дифференцировке (почки, половые железы, селезенка и др.) роль WT1 в подавлении теломеразы тканеспецифична.

Миелоподобный клеточно-специфичный белок MZF-2. В промоторе hTERT находится 4 участка связывания транскрипционного фактора MZF-2 в положениях 687, 619, 543 и 514. Они отвечают за угнетение активности промотора hTERT, и MZF-2 специфически связывается с этими участками. Суперэкспрессия MZF-2 подавляет активность промотора hTERT.

Регуляторные белки группы USF. Промотор hTERT содержит Е-блоки, с которыми могут связываться не только димеры Mys/Max и Mad/Max, но и регуляторные факторы USF.

В модельной системе с использованием репортерной конструкции экспрессия USF1 или USF2 ингибирует активность промотора. Эти белки не взаимодействуют с с-Myc и Mad и не влияют на их количество в клетке, а связываются напрямую с Е-блоками в промоторе hTERT. Анализ клинических препаратов нормальных и раковых клеток показал, что уровни экспрессии USF1 и USF2 ниже в раковых образцах.

USF1 и USF2 в виде гетеродимера взаимодействуют с обоими участками связывания в промоторе hTERT и подавляют транскрипцию hTERT.

В состав Ациона входят ингибиторы транскрипционных факторов ETS. Белки ETS – это семейство транскрипционных факторов, в состав которых входят консервативный ДНК-связывающий домен, специфичеcки взаимодействующий с последовательностями GGA(A/T).

MAP-киназы могут фосфорилировать белки ETS1 и ETS2 после активации фактором роста эпидермиса (EGF) и его гомологом HER2/Neu. Фосфорилированная форма ETS активна в транскрипции. Культивирование раковых клеток с EGF приводит к усилению промотора hTERT. Влияние EGF нивелируется при добавлении ингибитора MAP-киназ или удалении двух предполагаемых смежных участков связывания факторов ETS с промотором в районе 22 до 14 нп. EGF может приводить к фосфорилированию c-Myc, в результате чего последний активирует транскрипцию, но мутации участков связывания c-Myc в промоторе hTERT не влияют на способность EGF активировать транскрипцию. ETS взаимодействует с промотором hTERT ДНК в положении 36 нп, активируя, а в 293 нп – ингибируя экспрессию hTERT, образуя комплекс Ets-Id2-ДНК (Id-cемейство белков-регуляторов клеточного роста и ингибиторов дифференцировки). Суперэкспрессия ETS1 и ETS2, которую ингибирует Ацион, приводит к возрастанию теломеразной активности в раковых клетках.

Онкопротеин HER2/Neu активирует транскрипцию hTERT, используя в качестве посредника транскрипционный фактор ER81 из семейства ETS. Экспрессия только ER81 или HER2/Neu в раковой клеточной линии не стимулирует экспрессии mPHK hTERT и активность теломеразы. В модельной системе экспрессия ER81 и HER2/Neu увеличивает активность промотора в 3 и 9 раз соответственно, а их совместная экспрессия – в 37 раз. Найдено 5 возможных участков связывания, и для двух из них (в положениях 211+214 нп и 313+316 нп) доказана возможность связывания с ER81. Мутации только этих двух участков приводят к кооперативному уменьшению активации промотора hTERT c помощью ER81 и HER2/Neu. ERK MAP-киназы являются посредниками между HER2/Neu и ER81. Также показано, что Ras и Rat, являющиеся регуляторами ERK MAP-киназ, стимулируют транскрипцию hTERT.

Два других белка группы ETS того же подсемейства, что и ER81-PEA3 и ERM – также синергично с HER2/Neu активируют промотор hTERT.

Сигнальный путь рецептора Ck. Нарушение сигнального пути специфического к холестерину рецептора Сk обнаружено у больных лейкемией, раком центральной нервной системы и других раках.

Активированный рецептор Сk понижает экспрессию мРНК hTERT, ингибируя протеинкиназу С. Протеинкиназа С активирует транскрипцию PPAR-гамма (peroxisome proliferated receptor гамма), который ингибирует экспрессию c-Myc и hTERT, снижая активность теломеразы. Также PPAR-гамма может взаимодействовать с транскрипционным фактором SP1, являющимся активатором транскрипции hTERT.

Ацион содержит растительные антиэстрогены. Эстроген активирует транскрипцию hTERT в гормон-чувствительных тканях. При обработке клеток рака эстрогеном уже через несколько часов в них увеличивается уровень мРНК hTERT и активность теломеразы. Анализ промотора hTERT выявил 2 участка связывания рецепторов эстрогена. Участок связывания рецептора эстрогена в положении 2754 нп под действием гормона усиливает активность промотора в 5 раз. При удалении этого участка активация промотора hTERT эстрогеном уменьшается на 70%. Второй участок, в положении 949 нп, работает в кооперации с Sp1 сайтом, который примыкает к нему. С помощью футпринтинга показана защита участка 949 нп в присутствии эстрогена. Мутации этого участка сильно снижают активацию промотора hTERT эстрогеном в репортерной конструкции. В другой работе найдено связывание рецептора эстрогена только с участком 2754 нп, но не с 949 нп и обнаружено, что удаление участка 949 нп из промотора hTERT не влияет на активность промотора. С промотором hTERT связываются рецепторы эстрогена альфа и бета. Низкая теломеразная активность в ряде раков коррелирует с отсутствием рецептора эстрогена бета. Активация промотора hTERT в некоторых опухолевых клеточных линиях зависит от наличия альфа рецептора эстрогена, но не бета.

При регуляции эстрогеном реализуется схема многоуровневой активации теломеразы. Эстроген активирует теломеразу не только как непосредственный регулятор, но и за счет индукции другого активатора промотора hTERT – c-Myc.

Эстроген также активирует экспрессию hTERT через каскад PI3K/Akt/NF-kB. Эстроген также индуцирует фосфорилирование hTERT, связывание белков 14-3-3 и NF-kB c hTERT и накопление hTERT в ядре при посредничестве Akt-киназы.

В состав Ациона входят антиандрогены.

Нормальные ткани простаты и клеточные линии эпителия, как правило, не обладают теломеразной активностью в присутствии андрогенов, а их отсутствие не дает изменений активности теломеразы в тканях сердца, почек, печени, легких. В то же время большинство раков простаты имеют явно выраженную теломеразную активность при нормальном уровне андрогенов. Теломеразная активность в самых различных клеточных линиях, включая рак простаты угнетается, когда андрогены отсутствуют. Окрашивание антителами показало значительное угнетение экспрессии теломеразы в серии клинических образцов рака, включая рак простаты без андрогенов.

В клеточных линиях раков молочной железы и матки прогестерон увеличивает количество мРНК теломеразной обратной транскриптазы уже через 3 часа после инкубации. Через 12 часов количество достигает пика и начинает уменьшаться, а через 48 часов прогестерон (и его пептиды, входящие в состав Ациона) противодействуют эстрогену и ингибирует эстроген-индуцированную экспрессию мРНК hTERT. Активирующий эффект прогестерона осуществляется через каскад МАР-киназы, а ингибирование – при участии р21, также входящего в состав Ациона. Комбинация антагонистов эстрогена и пептидов прогестерона, входящего в состав Ациона вызывает угнетение активности теломеразы и увеличение экспрессии ее ингибиторов р53 и р21 в клеточной линии эпителия молочной железы.

При росте нормальных и андроген-независимых клеточных линий рака простаты в присутствии дигидротестостерона нет изменения теломеразной активности. в случае клеток андроген-зависимой раковой клеточной линии простаты LNCaP отсутствие андрогена в среде снижает теломеразную активность. Дигидротестостерон активирует теломеразную активность в G-1 фазе клеточного цикла. В то же время не происходит усиление активности промотора в опытах с репортерными конструкциями. Действие андрогена – непрямое, что подтверждается отсутствием элементов ответа на андроген в промоторе hTERT.

Ацион подавляет все известные онковирусы – вирус папилломы человека, вирус гепатита В, герпесвирусы (вирусы Эпштейна-Барр, саркомы Капоши), Т-лимфотропные вирусы, SV40, аденовирусы и многие другие.

Вирусная регуляция экспрессии hTERT, которую подавляет Ацион.

Вирус папилломы человека. Вирусы папилломы человека делят на 3 группы (неонкогенные, низкого и высокого риска) по вероятности неопластической трансформации зараженных клеток. Белки Е6 и Е7 вируса папилломы человека группы высокого риска участвуют в онкогенезе, инактивируя супрессоры р53 (Е6 совместно с Е6АР убиквитин белковой лигазой), PRB и ассоциированные с PRB белки р130 и р107 (е7) и еще ряд белков.

При трансфекции теломераза-негативных клеток (первичных кератиноцитов) генами Е6 и Е7 теломеразу активирует только Е6, но не Е7. В случае трансфекции клеток обоими генами (Е6+Е7) данные противоречивы: активность теломеразы может быть, как при трансфекции только геном Е6, несколько ниже или несколько выше. В клеточной линии рака шейки матки С33А (с активной теломеразой, но без вируса папилломы человека) экспрессия Е6 активирует экспрессию hTERT в 3 раза, Е7 – в 1,5 раза. В линии клеток эпителия молочной железы Е6 активирует теломеразу практически сразу, а Е7 ускоряет процесс появления в популяции теломеразной активности постепенно (через 20-25 пересевов при экспрессии Е7 обнаруживается высокая активность теломеразы). В целом Е6 является прямым активатором теломеразы, а возможная активация теломеразы белком Е7-опосредованный и слабый эффект.

Е6 активирует транскрипцию теломеразы, используя участок промотора от 260 нп до сайта инициации трансляции (15-260 нп), на котором расположены 2 участка связывания с-Myc, при удалении каждого из которых происходит падение активности на 60%. Е6 соосаждается с с-Myc при иммунопреципитации. Изменение уровня экспрессии с-Myc при трансфекции клеток геном Е6 не обнаружено. При суперэкспрессии гена, кодирующего Мах (белок-антагонист, конкурирующий с Myc), происходит подавление экспрессии hTERT, вызванное Е6. По данным других авторов, введение мутаций в оба участка связывания с-Myc дает лишь незначительное уменьшение активности промотора. В то же время мутации в сайтах связывания Sp1 приводят к практически полному исчезновению активации транскрипции теломеразы белком Е6.

В кератиноцитах и клетках эпителия молочной железы сильным активирующим теломеразу действием обладает Е6 у вирус папилломы человека группы высокого онкологического риска (ВПЧ16, ВПЧ18, ВПЧ31 и ВПЧ54), а в случае вирус папилломы человека группы низкого риска (ВПЧ11, ВПЧ6) активация транскрипции hTERT невелика. Белок Е6 вирусов папилломы только группы высокого риска связывается с минимальным промотором hTERT (-300-+1нп). Активация теломеразы белком Е6 является специфичной к типу клеток. Транскрипция клеток геном Е6, приводящая в случае клеток эпителия шейки матки к активации теломеразы, при использовании фибробластов или клеток IMR90 не дает аналогичного эффекта.

Компоненты Ациона угнетают ВПЧ-опосредованную активацию промотора hTERT. Эти компоненты ингибируют промотор hTERT путем их взаимодействия с Sp1, участки связывания которого находятся между Е-блоками. Ацион способен ингибировать рост ВПЧ-инфицированных клеток и приводить к апоптозу (гибели) раковые клетки самых различных линий.

Ацион нивелирует онкогенное влияние вируса гепатита В через подавление белка Х. Белок Х вируса гепатита В-транс-активатор, мишенями которого являются гены с-Myc, AP1, AP2, NF-kB, в свою очередь являющиеся активаторами теломеразы.

Частота встречаемости теломеразной активности увеличивается при переходе от нормальной ткани к раку: 79% раков, 24% цирроза и 8% хронического гепатита; в 85,2% раков, 49,9% цирроза печени, 25% хронического гепатита и 15% нормальных тканей.

При трансфекции клеточных линий геном белка Х вируса гепатита В происходит увеличение количества мРНК hTERT (клеточные линии гепатокарциномы и холангиокарциномы). С помощью Вестерн-блот-анализа обнаружено, что количество транскриптазы возрастает в клеточной линии гепатомы при суперэкспрессии белка Х вируса гепатита В.

Одновременно с hTERT обнаружено небольшое возрастание количества с-Myc при суперэкспрессии белка Х в клеточной линии гепатомы. Поскольку с-Myc активируется белком Х и активирует экспрессию hTERT, он является одним из посредников в активации теломеразы при поражении вирусом гепатита В. С другой стороны, связи экспрессии мРНК hTERT с уровнем с-Myc не обнаружено в клинических образцах рака печени методом гибридизации in setu.

В участках связывания с-Мус с промотором hTERT в клинических образцах гепатоклеточной карциномы встречаются мутации.

Участки возможного связывания ядерных гепатоцеллюлярных факторов HNF-3b и HNF-5 найдены в промоторах TERT у человека. Ацион предотвращает герпесвирусную регуляцию транскрипции hTERT. Итак, оба герпесвируса (вирусы Эпштейн-Барр, саркомы Капоши), являющиеся онкогенными для человека, участвуют в регуляции транскрипции hTERT.

Вирус Эпштейна-Барра является возбудителем инфекционного мононуклеоза и связан с образованием раков, например, с липомой и др.. Латентный мембранный белок 1 вируса Эпштейна-Барра индуцирует специфическое связывание hTERT с р65 субъединицей NF-kB и перенос обоих белков из цитоплазмы в ядро. Другой механизм активации экспрессии hTERT латентным мембранным белком 1 осуществляется путем трансактивации им с-Мус. Латентный мембранный белок вируса Эпштейна-Барра 2А угнетает транкрипционную активность гена hTERT.

Герпесвирус типа В идентифицирован как возбудитель множественной пигментированной саркомы кожи (Капоша). Ядерный антиген LANA этого вируса является активатором транскрипции hTERT. Этот белок может связываться с Sp1, и активация промотора теломеразы осуществляется в результате этого взаимодействия.

Ацион блокирует активацию теломеразы в раковых клетках, вызываемую Т-лимфотропными вирусами. Итак, Т-лимфотропные вирусы первого и второго типа активируют теломеразу.

У всех взрослых пациентов с острой или хронической формой Т-клеточной лейкемии обнаружена высокая активность теломеразы, в то время как у бессимптомных носителей Т-лимфотропного вируса 1-го типа активность теломеразы определяется лишь в 29% случаев. У 2-х из 7-ми пациентов с активной теломеразой произошел переход в острую форму в течение месяца. Теломеразная активность высока как в трансформированных Т-лимфотропными вирусами 1-го типа клетках, так и в лимфоцитах, полученных от больных лейкемией или лимфомой, по сравнению с нетрансформированными или нормальными клетками.

В регуляции транскрипции hTERT участвует белок Тах Т-лимфотропного вируса 1-го типа, который, несмотря на то, что является онкогеном, может угнетать экспрессию гена hTERT при стимуляции деления клеток фитогемагглютинином в 2 раза за 3-е суток. В отсутствии же фитогемагглютинина и при наличии Тах происходит увеличение теломеразной активности на 25% за то же время. При этом происходит активация экспрессии NF-kB, который, в свою очередь, активирует промотор hTERT. Угнетение активности промотора hTERT осуществляется в результате конкуренции Тах с с-Мус на канонический участок связывания с-Мус с промотором hTERT.

Составляющие комплекса Ацион нивелируют влияние гипоксии на экспрессию hTERT. Области гипоксии (кислородного голодания) раков характеризуются устойчивостью к воздействию, генетической нестабильностью и усилением злокачественной прогрессии. Гипоксия может приводить к усилению теломеразной активности, например, в клеточных линиях рака шейки матки. Промотор hTERT содержит в своей основной части 2 участка связывания гипоксия-индуцируемого фактора 1 в областях 242 и 26 нп. Обнаружено, что эти участки действительно необходимы для активации hTERT с помощью гипоксия-индуцируемого фактора 1. Инкубация раковых клеточных линий в условиях недостатка кислорода приводит к сборке транскрипционного комплекса, включающего в себя гипоксия-индуцируемый фактор 1, р300/СВР, РНК-полимеразу II и TFIIB на промоторе в районе участков ответа на гипоксию. Суперэкспрессия гипоксия-индуцируемого фактора 1 в клеточной линии яичников приводит к более чем двукратному росту активности промотора hTERT. При росте раковой клеточной линии в условиях гипоксии без суперэкспрессии гипоксия-индуцируемого фактора 1 происходит перераспределение сплайс-форм мРНК hTERT при очень незначительном увеличении количества суммарной мРНК hTERT.

Ацион стиулирует искусственный сплайсинг за счет 2-0-метил-РНК фосфатионата олигонуклеотидов, входящих в его состав.

Посттрансляционная регуляция hTERT. Необходимым для раков является поддержание длины теломер и активность поддерживающей их теломеразы может не коррелировать с транскрипцией hTR или мРНК hTERT.

Ген теломеразной обратной транскриптазы состоит из 15 экзонов, при этом он занимает 37 000 пар оснований геномной ДНК, из которых 33 000 пар оснований приходится на интроны и 4 000 пар соответствуют транскрипту.

Природный сплайсинг мРНК hTERT. Только полноразмерная мРНК hTERT обеспечивает активность теломеразы. Известно 13 альтернативных

вариантов сплайсинга мРНК hTERT. Изоформа с так называемой альфа-делецией (делеция 36 нуклеотидов в обратно-транскриптазном домене) при суперэкспрессии является доминантным ингибитором теломеразной активности. Этот вариант мРНК hTERT транслируется, и получающийся белок может включаться в виде димера.

Делеция бета или альфа+бета не приводят к образованию активной теломеразы, но и не ингибируют ее. В то же время при обработке бессмертной клеточной линии фактором TGF бета 1 (трансформирующий фактор роста бета 1), образуется бета-вариант мРНК hTERT в результате альтернативного сплайсинга, и активность теломеразы падает. Компоненты комплекса Ацион стимулируют TGF бета 1. Обратная ситуация может складываться в области гипоксии раков (которой противодействует Ацион): происходит перераспределение от бета-варианта сплайсинга к активному транскрипту.

Теломеразная активность в клетках линий, например, остеосаркомы, экспрессирующих только полноразмерную мРНК, выше, чем в случае клеток с набором различных сплайсинг-форм мРНК hTERT. В ткани аденокарциномы желудка теломеразная активность возрастает, общее количество мРНК hTERT увеличивается по сравнению с окружающей нормальной тканью, а соотношение количеств альфа, бета, альфа+бета форм в них одинаково, что указывает на отсутствие регуляции сплайсинга hTERT.

Вариант с делецией гамма экспрессируется мало и не оказывает заметного эффекта на теломеразную активность в клеточных линиях, полученных из рака печени. Делеции альфа+бета, бета и 4 вставки INS 1-4 вызывают преждевременную терминацию трансляции hTERT, как и варианты с делециями бета+гамма, альфа+бета+гамма. Часть транскриптов, найденная недавно, пока не описана с точки зрения их влияния на активность теломеразы.

Регуляция теломеразы с помощью сплайсинга является тканеспецифичной. При исследовании образцов тканей зародыша оказалось, что в сердце и печени теломеразная активность коррелирует с экспрессией гена hTERT, в почках она исчезает на 15-й неделе развития, а транкрипты hTERT обнаруживаются на 21 неделе.

Ацион стимулирует искусственный сплайсинг. В клеточной линии рака 2-0-метил-РНК-фосфонат олигонуклеотиды Ациона, тропные к участку сплайсинга между 5 интроном и 6 экзоном в hTERT пре-мРНК, уменьшают количество полноразмерного транскрипта и одновременно увеличивают количество альтернативно-сплайсированного транскрипта, что приводит к снижению теломеразной активности в раковых клетках. При этом уменьшается скорость роста, и через два дня раковые клетки начинают входить в состояние апоптоза (гибели).

In vitro высокая активность теломеразы наблюдается в цитоплазматическом экстракте, а не в ядерном, хотя для работы теломеразы в клетке она должна быть локализована вместе с теломеразами в ядре. При этом in vivo GFP-содержащая теломераза локализуется в ядре.

При связывании NF-kB (р65 субъединица) с белком hTERT фактор некроза опухолей альфа индуцирует перенос из цитплазмы в ядро hTERT, связанный с NF-kB.

Белок 14-3-3, отвечающий за ядерную локализацию, связывается с теломеразой. Доминант-негативный 14-3-3 направляет в цитоплазму hTERT, в норме локализованный в ядре. Мутантный hTERT, не способный связываться с 14-3-3, локализуется в цитоплазме.14-3-3 мешает связываться белку CRM 1, c NES-мотивом (nuclear export signal, сигнал экспорта из ядра. Ингибирование CRM 1 (экспортин 1 пути ядерного экспорта, как и нарушение NES-мотива, приводит к уменьшению локализации hTERT в цитоплазме.

hTERT большую часть клеточного цикла не локализется в нуклеолях, тельцах Кахаля или теломерах. В S-фазе клеточного цикла hTERT перемещается в нуклеоли, затем в тельца Кахаля и затем на теломеры.

Ацион регулируют фосфорилирование и дефосфорилирование hTERT. Фосфорилирование теломеразной обратной транскриптазы протеинкиназой «С» альфа требуется для активации теломеразы в клетках рака молочной железы. Другая протеинкиназа этой группы, протеинкиназы «С2» контролирует теломеразную активность в клетках рака носоглотки без влияния на экспрессию hTERT. В этом случае под действием Ациона выключение активатора протеинкиназы С2 Cdc42/Rac1 приводит к уменьшению теломеразной активности.

Активированная Ационом фосфатаза РР2А ингибирует теломеразную активность в клетках рака молочной железы.

Активированная киназа Akt (доминант-негативная) значительно снижает уровень теломеразной активности в клетках эндотелия. Также подавляет теломеразную активность ингибирования киназы PI3K (phosphoinosital 3-kinase), фосфорилирующей и активирующей Akt.

Фосфорилирование влияет не только непосредственно на активность hTERT, но и на транскрипцию этого гена. Обработка клеток ингибитором PI3K Ациона или экспрессия в них под действием Ациона доминант-негативной Akt- киназы ослабляет транскрипционную активации промотора hTERT эстрогеном в клеточных линиях рака яичника человека.

Тирозин-киназа с-Abl, также активируемая Ационом, связывается с hTERT и фосфорилирует его, ингибируя активность. Облучение клеток ионизирующим излучением также индуцирует фосфорилирование hTERT по с-Abl-зависимому механизму.

При окислительном стрессе hTERT экспортируется из ядра с помощью ГТФазы Ran (hTR) в опухолевых клетках. В тканях взрослых людей высокий уровень экспрессии теломеразной РНК обнаружен в первичных сперматоцитах и клетках Сертоли, средний уровень экспрессии в лимфатических фолликулах, слабый уровень экспрессии – в эпителии, а в клетках нервной системы и тканях, происходящих из мезенхимы, экспрессия hTR отсутствует. Заметный уровень экспрессии обнаружен в тонком кишечнике, яичниках, селезенке, тимусе, почках и простате. Низкий уровень экспрессии hTR наблюдается в мозге, печени, желудке, поджелудочной железе, легких и сердце.

В теломераза-положительных образцах опухолевых тканей наблюдали сильную экспрессию hTR, а в теломераза-негативных саркомах мягких тканей только половина экспрессировала hTR в различной степени. В теломераза-негативных опухолях нет связи между экспрессией hTR и пролиферативным статусом, длиной теломер и экспрессией hTERT. Повышенная экспрессия hTR не связана с теломеразной активностью.

Методом in situ гибридизации определено, что в случае пищевода Баррета и дисплазии пищевода ранней стадии hTR велика. В образцах рака легких в случае применения ОТ-ПЦР (обратной транскрипции и ПЦР) hTR выявляется в 90-100% случаев образцов как раковых, так и нормальных тканей. При определении в раке легких методом гибридизации in situ hTR обнаруживается всего в 26% раковых тканей, определенных гистологическим анализом, для некоторых образцов хорошо определяется разница между раковыми и нормальными тканями. Эти же методом определена экспрессия hTR в 41% плоскоклеточной карциномы 13% и 17% аденокарцином молочной железы и яичников, 43% рака и 40% предраковых поражений шейки матки. К сожалению, неизвестна дальнейшая судьба пациентов с предраковыми поражениями, поэтому невозможно говорить об экспрессии hTR в качестве ракового маркера. Необходимо проводить точный количественный анализ в отличие от экспрессии hTERT или определения теломеразной активности.

При анализе нейробластом в 9 из 12 образцах раков средних стадий и только в 2 из 8 образцов раков ранних стадий обнаружен высокий или средний уровень экспрессии hTR. Заболевание не прогрессировало у пациентов с низким уровнем экспрессии hTR или без нее. В случае 8 образцов раков (от 7 пациентов) со средним или высоким уровнем экспрессии hTR развитие болезни было неблагополучным. Следует отметить, что в случае поздней стадии болезни с обширными метастазами (и образца) экспрессия hTR была слабой. Экспрессия hTR в ганглио-нейробластомах и ганглионейронах ограничена только нервными клетками, в леммоцитах она отсутствует. Таким образом, в неместазирующих нейробластомах экспрессия hTR оказалась хорошим прогностическим фактором.

Для рака Вильямса именно экспрессия hTR, но не hTERT, является предсказательным фактором дальнейшего развития. У 30% пациентов с наибольшей экспрессией hTR (количественную оценку проводили ОТ-ПЦР в реальном времени) вероятность рецидива вдвое выше по сравнению с пациентами с наименьшим уровнем экспрессии hTR. Также высокий уровень экспрессии hTR коррелирует с плохим прогнозом у пациентов с липосаркомой.

Повышение экспрессии hTR не всегда совпадает с появлением теломеразной активности. hTR ингибирует протеинкиназу контрольных точек ATR. Подавление уровня экспрессии hTR под действием Ациона приводит к остановке клеточного цикла в G1-G2- фазах в результате действия белка р53 и активации протеинкиназы контрольных точек СРК1. Этот эффект не зависит от теломеразной активности. Возрастание экспрессии hTR в ответ на ультрафиолетовое облучение предотвращает активацию р53 и СНК1 в результате ингибирования активности ATR, тем самым ослабляя клеточный ответ на повреждение ДНК и позволяя клеткам проходить контрольную точку G2/M.

Ацион содержит ряд компонентов, регулирующих транскрипцию теломеразной РНК (hTR). Промотор hTR содержит ССААТ- и ТАТА-блоки рядом с участком старта транскрипции и ряд участков связывания: рецепторов глюкокортикоидов, прогестерона и андрогена; транскрипционных факторов АР1 и ETS. Минимальный участок промотора теломеразной РНК человека -272-4 нп до участка старта транскрипции.

Активность промотора максимальна при использовании участка до 463 нп, при использовании большего участка промотора происходит уменьшение транскрипции.

При проверке статуса метилирования промотора hTR 3 из 8 теломераза-положительных клеточных линий и обе теломераза-негативных оказались гиперметилированы, при этом в образцах операционных материалов метилирование промотора hTR не наблюдалось ни в раковых, ни в нормальных тканях. Таким образом, метилирование промотора скорее всего не связано с регулированием экспрессии hTR.

Промотор hTR содержит 4 участка связывания белков Sp1/Sp3. Связывание Sp1 активирует промотор, а SP3 ингибирует его. Мутационный анализ показал, что участок до ССААТ-блока нужен для активации промотора hTR, а 3 участка после ССААТ отвечают за ингибирование промотора. Участок, находящийся сразу после ССАТ, имеет наибольший ингибирующий эффект, хотя и наименьшее сродство к Sp1. Это можно объяснить его близостью к участку связывания транскрипционного фактора NF-4. Два участка, находящиеся после старта транскрипции, подвергаются сложной регуляции, поскольку внесение мутации в оба участка дает сильный активирующий эффект, не равный сумме эффектов мутаций участков по отдельности. С другой стороны, по результатам одной научной работы одновременное внесение мутаций в 4 участка связывания Sp1 не влияет на базовый уровень активности промотора hTR, хотя и нарушает его трансрегулирование.

Транскрипционный фактор NF-Y, способный рекрутировать на промотор ряд компонентов комплекса РНК-полимеразы II, является основным активатором промотора теломеразной hTR. NF-Y связывается с участком ССААТ промотора hTR, а при нарушении этого связывания активность промотора практически пропадает.

Активность промотора hTR также является PRB. Для его действия необходим участок ССААт. Активирование промотора hTR белком PRB снижается при использовании мутантных PRB не способных связывать E2F, и пропадает при использовании мутанта 657, не способного связывать и активировать транскрипцию генов.

Митоген-активируемая протеинкиаза киназы 1- (MEKK1)/c-Jun-NH92)-kinase (JNK), вызывает сильное ингибирование промотора hTR в ряде раковых клеточных линий. Угнетение промотора hTR киназой MEKK 1 можно усиливать с помощью SP600125 (в составе Ациона) – ингибитора JNK. Эффект ингибирования промотора hTR может быть усилен коэкспресией JNK дикого типа, но не экспрессией мутантной формы JNK, не способной фосфорилироваться. Котрансфекция Sp3 MEKK 1 дает аддитивный эффект ингибирования hTR. Обработка клеток SP600125 приводит к изменению соотношения количеств Sp1, согласно иммунопреципитации. Таким образом, эта киназа способствует смещению баланса Sp1/Sp3, связанных с промотором, пользу Sp3 без изменения в уровне экспрессии Sp1 и Sp3 и ингибированию промотора hTR.

Убиквитинлигаза Mdm2 регулирует стабильность р53 и регулирует комплекс PRb/E2F. Mdm2 взаимодействует с SP1 in vitro и in vivo и ингибирует его, причем участки связывания Sp1 не принимают в этом участия. Mdm2 регулирует активацию, вызываемую PRb, NF-Y, могут взаимодействовать с аппаратом РНК-полимеразы II и в результате этого подавляют экспрессию hTR в раковых клетках.

Ген теломеразной РНК содержит участок HRE, с которым связывается HIF-1. Суперэкспрессия в раковых клетках фактора HIF-1 приводит к почти двукратному росту активации промотора hTR через 6 часов после инкубации в условиях гипоксии и затем падению до нормального уровня в течение 4 часов. На промоторе hTR в раковой клеточной линии в условиях гипоксии собирается транскрипционный комплекс, включающий в себя HIF-1, p300, РНК-полимеразу II и TFIIB, который блокирует Ацион.

Аденовирусный белок E1A увеличивает экспрессию репортерной конструкции под контролем промотора hTR в 2,5 раза. Эта активация скорее всего осуществляется через участки связывания Sp1, поскольку их мутации приводят к исчезновению эффекта Е1А. Активация промотора hTR белком Е1А также ингибируется Ационом, но не оказывает влияния на базовый уровень экспрессии hTR в здоровых тканях.

Ацион способствует осуществлению посттранскрипционной регуляции теломеразной РНК. Теломеразная РНК накапливается в тельцах Кахаля в клетках раковых линий, но не в клетках нормальных тканей. Накопление hTR в тельцах Кахаля происходит через экспрессию в клетках hTERT, которую подавляет Ацион. Именно hTERТ является ключевым фактором локализации hTR как в тельцах Кахаля, так и на теломерах. Для накопления в тельцах Кахаля также необходим предшествующий процессинг 3-конца hTR.

Это нарушает стабильность раковой теломеразной РНК в клетках, где она возрастает при онкогенезе. При экспрессии hTERТ в hTERT-негативных клетках период полураспада hTR возрастает в 1,6 раза. Вероятно, это происходит за счет связывания и стабилизации TR каталитической субъединицей.

Эти белки осуществляют контроль доступа теломеразы на теломеры. Теломеры имеют выступающий 3-конец, который образует несколько структур: Т-петлю, G-квадродуплексы. В Т-петле выступающий 3-конец спарен с внутренней областью теломеры за счет Хугстейновских пар. У человека 6 белков (NRF1, TRF2, hRap1, TIN2, TPP1 и POT1) формируют так называемый комплекс, который является постоянным компонентом человеческих теломер.

Изменение уровня экспрессии белков шелтеринового комплекса резко отражается на длине теломер. Так, ингибирование TRF1 приводит к удлинению теломер в человеческих раковых клетках, а его суперэкспрессия при действии Ациона приводит к укорочению в них теломер без изменения теломеразной активности в здоровых клетках. Уменьшение количества белка TIN2 или суперэкспрессия его мутантных аллелей, которые нарушают связывание TIN2 c TRF1 и TRF2, приводит к удлинению теломер, которому препятствует Ацион. Суперэкспрессия TRF2 под действием Ациона вызывает укорочение теломер, происходящее не только за счет ингибирования теломеразы, но и за счет увеличения скорости укорочения теломер в раковых клетках. В экспериментах подавление ТРР1 (который активирует Ацион) с помощью интерферирующей РНК или нарушение связывания ТРР1-РОТ1 также приводит к удлинению теломер в раковых клетках, сопровождающемуся потерей теломерами белка РОТ1.

Компоненты комплекса Ацион влияют на подавление выработки белка РОТ1. РОТ1 связывает одноцепочечную теломерную ДНК с высокой специфичностью, используя 2ОВ-мотива (oligonucleotide/oligosaccharide-binding folds). Супер-экспрессия РОТ1 без первого ОВ-мотива приводит к быстрому удлинению теломер. Уменьшение экспрессии hPOT1 также может приводить к удлинению теломер. У другой группы исследователей экспрессия полноразмерного белка приводит к удлинению теломер в раковых клетках. Связывание рекомбинантного РОТ1 с теломерным олигонуклеотидом ингибирует связывание теломеразы. С другой стороны, РОТ1 in vitro способен разрушить квадродуплексные структуры, которые образуются за счет Хугстейновского спаривания нуклеотидов в теломерной ДНК. Это объясняет, как РОТ1 вносит положительный вклад в теломераза-зависимое удлинение теломер, поскольку G-квадродуплексы представляются очень плохим субстратом для теломеразы. Разрушение G-квадродуплексов также могут осуществлять хеликазы WRN или BLM семейства RecQ которые взаимодействуют с РОТ1. У человека мутации в генах, кодирующих хеликазы WRN или BLM, приводят к развитию синдромов Блюма и Вернера соответственно, характеризующихся геномной нестабильностью.

Более длинные теломеры содержат больше шелтеринового комплекса, который является датчиком длины теломер. Связывание белка РОТ1 с шелтерином может влиять на посадку РОТ1 на одноцепочечный участок теломерной ДНК. Также шелтерин может ингибировать теломеразу, облегчать образование Т-петли, в которой 3-конец недоступен.

Количество мРНК РОТ1 в случае рака желудка на начальных стадиях чаще уменьшается, а на поздних стадиях возрастает. Уровень экспрессии РОТ1 уменьшается в соответствии с укорочением теломер. Кроме того, ингибирование РОТ1 в клеточных линиях различных раков с помощью антисмысловых олигонуклеотидов Ациона приводит к укорочению теломер в раковых клетках, также, как и ингибирование теломеразной активности в них.

Посадка теломеразы на теломеры может регулироваться за счет образования/разрушения G-квадродуплексов. Связывающий одноцепочечную ДНК белок RPAспособен расплетать теломерные G- квадродуплексы. С другой стороны, RPA способен ингибировать теломеразную активность за счет связывания с теломер-имитирующим олигонуклеотидом. Ингибирование теломеразы происходит и при удалении из смеси RPA, и при его избытке при приеме Ациона.

Регуляция в ходе ответа на ионизирующее излучение и химиотерапию. Комплекс Ацион рекомендуется применять также в сочетании с лучевым и химиотерапевтическим излучением.

При изучении процессов, происходящих при онкогенезе, нельзя обойти

вниманием последствие воздействия на клетки различных видов излучений.

С одной стороны, они способны провоцировать онкогенные процессы, а с другой стороны, различные типы излучений применяются для борьбы с раком (бета-частицы, нейтроны, гамма- и рентгеновское облучение и т. д.). Поскольку активность теломеразы ассоциирована с большим числом раков, логичен вопрос, что же происходит с этой активностью при облучении? Также представляется интересным, может ли облучение вызывать активность теломеразы?

При изучении воздействия ионизирующего излучения на клеточную линию HeLa обнаружено, что теломеразная активность и количество мРНК hTERT возрастает в первые 24 часа, вплоть до двукратного превышения по сравнению с необлученными образцами, а потом за 72 часа возвращаются к исходному уровню.

При воздействии на клетки гемопоэтической клеточной линии гамма и нейтрон/гамма-излучения наблюдается увеличение теломеразной активности и количества мРНК hTERT, зависящее от дозы и интенсивности облучения. В случае нейтрон/гамма излучения сначала происходит уменьшение, а затем увеличение теломеразной актвности. Влияние излучений разной энергетики различается по величине и кинетике, но одинаково по воздействию на клетки. Изменения в теломеразной активности не связаны ни с изменением клеточного цикла, ни с индукцией клеточной смерти, а являются последствиями специфических регуляторных ответов на ионизирующее излучение.

Клетки рака при воздействии компонентов комплекса Ациона становятся более восприимчивыми к воздействию химиотерапевтических агентов и облучению. Для сравнения, клетки с более длинными теломерами проявляют большую устойчивость к химиотерапевтическим агентам и облучению.

Знания о системе регуляции теломеразы в раковых клетках, а также механизмов альтернативного удлинения теломер в этих клетках позволили создать эффективное средство Ацион для подавления теломер в раковых клетках.

Помимо функции биологического счетчика количества делений раковых клеток, постоянно удлиняющиеся теломеры способствуют неограниченному делению этих клеток и являются «защитным колпачком» для субтеломерной ДНК, на которой записана информация об антиапоптотических белках, которые, противодействуя апоптотическим белкам, приводят к раковому клеточному бессмертию. Ацион ограничивает деление раковых клеток, противодействуя удлинению теломер, и вызывая их критическое укорочение. Вследствие укорочения теломер обнажаются субтеломерные участки ДНК раковых клеток, после чего они подвергаются гидролизу, и клетка прекращает сопротивляться апоптозу и гибнет.

Форма выпуска: 30 капсул весом 370 мг.

Способ применения: по 1 капсуле в день во время еды в течение 30 дней.

Ограничения: аллергические реакции, индивидуальная непереносимость компонентов, беременность, кормление грудью.